重組膠原蛋白純化秘籍：不同表達(dá)體系的純化工藝核心與FAQ解析
膠原蛋白是哺乳動物細(xì)胞中最主要的蛋白成分，占全身總蛋白的30%左右，其廣泛存在于皮膚、骨骼、肌腱和韌帶中，主要提供機(jī)體的強(qiáng)度、支撐、修復(fù)和連接作用。結(jié)構(gòu)完整的膠原蛋白是由三條氨基酸鏈互相纏繞形成，也決定了其生物學(xué)活性。膠原蛋白市場火熱，重組膠原蛋白以其來源穩(wěn)定安全，產(chǎn)物純度高結(jié)構(gòu)可控且不具備病原體風(fēng)險等優(yōu)點，受到各膠原蛋白生產(chǎn)廠家的青睞。重組膠原蛋白是通過將人類膠原蛋白的某功能區(qū)的基因片段插入微生物或動物細(xì)胞中重組表達(dá)，通過大規(guī)模發(fā)酵后分離提純而得。賽分科技總結(jié)實際應(yīng)用經(jīng)驗，整理了重組膠原蛋白下游純化工藝及常見問題解析。
重組膠原蛋白下游純化工藝
生物大分子重組表達(dá)后一般需要經(jīng)過下游分離提純才能得到高純度高質(zhì)量的產(chǎn)品，整個過程主要依賴的是目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)之間的性質(zhì)差異來進(jìn)行分離，重組膠原蛋白的雜質(zhì)主要分為以下幾個類型：HCP（宿主殘留蛋白）、降解片段、內(nèi)毒素、色素等。由于膠原蛋白應(yīng)用主要在醫(yī)美領(lǐng)域，產(chǎn)品附加值相較于生物大分子藥偏低，因此其對于成本控制要求較高。為此，賽分科技推出了一系列高性價比的膠原蛋白純化解決方案。
圖1. 重組膠原蛋白純化基本流程
膠原蛋白常見表達(dá)體系有酵母體系和大腸桿菌體系，由于市場近期對全長膠原蛋白回饋比較好，因此有部分企業(yè)也使用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)全長的膠原蛋白。表達(dá)體系不同，雜質(zhì)表現(xiàn)也有不同情況的差異性。
酵母表達(dá)體系
由于酵母體系多為分泌型表達(dá)，因此發(fā)酵液純度相對較高，經(jīng)過前處理基本可以維持至60%~80%的純度水平。市面上常見的膠原蛋白類型主要有I型、III型和V型，這三類膠原蛋白的實際pI一般都大于7，同時我們發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母HCP的pI多呈現(xiàn)酸性，因此可利用其帶電性的差異，使用陽離子交換層析進(jìn)行捕獲分離，陽離子交換層析載量高，價格便宜，是放大生產(chǎn)的不錯選擇。另外膠原蛋白由于長鏈結(jié)構(gòu)的特殊性，并且重組表達(dá)大多不具備三級結(jié)構(gòu)，多呈現(xiàn)單鏈狀態(tài)，樣品的穩(wěn)定性一般，因此很多樣品都有不同程度的降解碎片，且有些降解碎片和目標(biāo)物相差很小，僅用陽離子交換很難達(dá)到較好的分離。通過實驗驗證我們得出疏水層析對目標(biāo)物和片段有不錯的分離度，并且膠原蛋白的一級結(jié)構(gòu)通常含有一些羥脯氨酸、羥賴氨酸，所以膠原蛋白的親水性相較于HCP的親水性更強(qiáng)。綜上所述，對于發(fā)酵液純度高且降解片段少的樣品，推薦采取陽離子交換層析的模式去捕獲純化；對于發(fā)酵液純化低且降解片段又比較高的樣品，推薦采用陽離子復(fù)合疏水層析（MMC）去做第一步的捕獲層析。若一步層析比較難達(dá)到要求，可增加一步疏水層析做為精純步驟。
推薦填料：
陽離子交換層析：Agarosix-SP Excel，Monomix HC60-SP
復(fù)合陽離子交換層析：Agarosix MC75/45-MMC
疏水層析：Generik MC60/30-HIC Butyl，Polar MC60/30-HIC Phenyl
大腸桿菌表達(dá)體系
對于大腸桿菌的胞內(nèi)可溶性表達(dá)樣品，經(jīng)過破胞和澄清過濾后HCP水平依然較高，因此大多數(shù)都會在分子構(gòu)建階段加入組氨酸標(biāo)簽利用His-tag親和層析做為第一步捕獲純化。但由于膠原蛋白通常含有降解片段，且有一部分降解片段依然含有His-tag。因此通過Ni親和層析后純度依然不能大于95%，需要增加一步層析做為精純步驟。精純步驟可選取陽離子交換層析或者疏水層析作考慮。若沒有標(biāo)簽可參考酵母體系的純化工藝。
推薦填料：
Ni親和：Agarosix MC90-NTA Ni，Agarosix MC90-Ni Excel
陽離子交換層析：Agarosix-SP Excel，Monomix HC60-SP
復(fù)合陽離子交換層析：Agarosix MC75/45-MMC
疏水層析：Generik MC60/30-HIC Butyl，Polar MC60/30-HIC Phenyl
哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系
哺乳動物細(xì)胞全長表達(dá)（非全長可參考酵母體系）：常規(guī)的全長表達(dá)純化工藝可參考酵母體系的純化工藝（MMC+HIC模式），但由于膠原蛋白長度非常長（資料顯示通常三螺旋全長在200-300 nm），很難進(jìn)入層析介質(zhì)微球的孔里，因此可采取非常規(guī)模式去進(jìn)行層析：
1. 采用核殼結(jié)構(gòu)復(fù)合模式的層析填料，如賽分科技的Monomix Core 500層析介質(zhì)，其以高聚物為基球，孔徑非常均一，外殼采用特殊處理不和樣品吸附，內(nèi)核擁有疏水氨基的配體，可以在特定條件下將進(jìn)入孔的分子量相對較小的HCP及片段吸附，全長的膠原流穿從而達(dá)到分離效果。
2. 嘗試使用離子交換的流穿模式，由于膠原蛋白很難進(jìn)入層析填料的孔里，其載量相對很低，因此我們可以嘗試上較高的載量，使雜質(zhì)蛋白結(jié)合在填料上，由于上樣載量高，結(jié)合在填料上的比例相對較低，也可以有不錯的回收率。
推薦填料：
核殼復(fù)合模式：Monomix Core 500
陽離子交換層析：Agarosix-SP Excel，Monomix HC60-SP
復(fù)合陽離子交換層析：Agarosix MC75/45-MMC
常見問題解答（FAQ）
膠原蛋白類型眾多，不同表達(dá)體系、不同功能區(qū)域片段都有較大的性質(zhì)差異，下游純化過程中如果有某些特殊分子還需要做相應(yīng)調(diào)整。經(jīng)過實際經(jīng)驗積累，賽分科技總結(jié)了重組膠原蛋白純化的一些常見問題，為下游工藝優(yōu)化提供解決方案。
Q1·膠原蛋白在下罐以后，發(fā)生比較嚴(yán)重的降解，可能的原因及解決方法？
有可能是因為存在蛋白酶水解位點，可以在下罐以后采取高溫孵育法滅火蛋白酶，以及在發(fā)酵上清加入低濃度的EDTA。
Q2·膠原蛋白色素去除困難，選哪種層析方法？
發(fā)酵色素類型較多，常規(guī)的類型有金屬離子，糖類，糖蛋白類等，純陽離子交換很難去除的比較徹底，通常可以使用帶有疏水性質(zhì)的復(fù)合離子交換層析MMC填料（Agarosix MC75/45-MMC）或者使用疏水層析色素去除效果會比較好。
Q3·陽離子或MMC層析在某些項目工藝復(fù)現(xiàn)不好，應(yīng)該怎么辦？
由于膠原蛋白的特殊結(jié)構(gòu)，其長度較長可能存在蛋白在填料上占用配位點不均一的情況，因此需要嚴(yán)格控制各組分Buffer的電導(dǎo)和pH（pH計和電導(dǎo)儀也需要經(jīng)常校準(zhǔn)）。
Q4·如何進(jìn)行內(nèi)毒素去除？
由于三類醫(yī)療器械要求對內(nèi)毒素比較高，通常需要做到0.01 EU/mg以下，常規(guī)我們可以選擇配基密度較高的強(qiáng)陰離子交換層析介質(zhì)（Monomix Mab60-Q）。純化條件我們盡可能選擇較高的pH和較低的電導(dǎo)（pH需要低于樣品pI防止樣品結(jié)合，另外有些樣品高pH不穩(wěn)定，可在去除效果和穩(wěn)定性平衡選擇較好的pH條件）。
Q5·酵母發(fā)酵體系的層析前處理需要超濾換液或稀釋降低電導(dǎo)，層析方法如何選？
某些樣品可以采用離子交換復(fù)合疏水模式的MMC填料（Agarosix MC75/45-MMC）在不降低電導(dǎo)的情況下，直接進(jìn)行上樣捕獲，載量也不受影響。
延展閱讀
賽分科技針對重組膠原蛋白可提供完整的純化解決方案，純化效率高、通用性強(qiáng)，更有“明星產(chǎn)品”Agarosix MC75/45-MMC復(fù)合陽離子填料推薦及案例分享，歡迎閱讀：
重組膠原蛋白純化“明星產(chǎn)品”—Agarosix MC75/45-MMC
重組膠原蛋白純化解決方案
推薦填料及訂購信息
注：包裝規(guī)格為1L，5 L, 10 L, 50 L，預(yù)裝柱規(guī)格為1 mL, 4.2 mL, 5 mL
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